菌種保藏的方法

　菌種是主要的生物資源，也是食用菌生產(chǎn)首要的生產(chǎn)資料。一個優(yōu)良的菌種被選育出來以后，必須保持其優(yōu)良性狀不變或盡可能地少變慢變，才不至于降低生產(chǎn)性能，能長期在生產(chǎn)中使用。因此，菌種保藏在食用菌生產(chǎn)上具有重要的意義。
　　
　　各種微生物由于遺傳特性不同，因此適合采用的保藏方法也不一樣。一種良好的有效保藏方法，首先應(yīng)能保持原菌種的優(yōu)良性狀長期不變，同時還須考慮方法的通用性、操作的簡便性和設(shè)備的普及性。下面介紹幾種常用的菌種保藏方法：
　　
　　（一）斜面低溫保藏法
　　
　　將菌種接種在適宜的斜面培養(yǎng)基上，待菌種生長*后，置于4℃左右的冰箱中保藏，每隔一定時間（保藏期）再轉(zhuǎn)接至新的斜面培養(yǎng)基上，生長后繼續(xù)保藏，如此連續(xù)不斷。此法廣泛適用于細(xì)菌、放線菌、酵母菌和霉菌等大多數(shù)微生物菌種的短期保藏及不宜用冷凍干燥保藏的菌種。放線菌、霉菌和有芽孢的細(xì)菌一般可保存6個月左右，無芽孢的細(xì)菌可保存1個月左右，酵母菌可保存3個月左右。如以橡皮塞代替棉塞，再用石蠟封口，置于4℃冰箱中保藏，不僅能防止水分揮發(fā)、能隔氧，而且能防止棉塞受潮而污染。這一改進(jìn)可使菌種的保藏期延長。
　　
　　此法由于采用低溫保藏，大大減緩了微生物的代謝繁殖速度，降低突變頻率；同時也減少了培養(yǎng)基的水分蒸發(fā)，使其不至于干裂。該法的優(yōu)點(diǎn)是簡便易行，容易推廣，存活率高，故科研和生產(chǎn)上對經(jīng)常使用的菌種大多采用這種保藏方法。其缺點(diǎn)是菌株仍有一定程度的代謝活動能力，保藏期短，傳代次數(shù)多，菌種較容易發(fā)生變異和被污染。
　　
　?。ǘ?/span>石蠟油封藏法
　　
　　此法是在無菌條件下，將滅過菌并已蒸發(fā)掉水分的液體石蠟倒入培養(yǎng)成熟的菌種斜面（或半固體穿刺培養(yǎng)物）上，石蠟油層高出斜面頂端lcm，使培養(yǎng)物與空氣隔絕，加膠塞并用固體石蠟封口后，垂直放在室溫或4℃冰箱內(nèi)保藏。使用的液體石蠟要求無毒，化學(xué)純規(guī)格，其滅菌條件是：150～170℃烘箱內(nèi)滅菌lh；或121℃高壓蒸汽滅菌60～80min，再置于80℃的烘箱內(nèi)烘干除去水分。
　　
　　由于液體石蠟阻隔了空氣，使菌體處于缺氧狀態(tài)下，而且又防止了水分揮發(fā)，使培養(yǎng)物不會干裂，因而能使保藏期達(dá)1～2年，或更長。這種方法操作簡單，它適于保藏霉菌、酵母菌、放線菌、好氧性細(xì)菌等，對霉菌和酵母菌的保藏效果較好，可保存幾年，甚至長達(dá)10年。但對很多厭氧性細(xì)菌的保藏效果較差，尤其不適用于某些能分解烴類的菌種。
　　
　　有試驗(yàn)指出，此法用于保藏紅曲霉很合適，保藏1～2年后存活率為100％；也有報道顯示，某些蕈菌菌絲用石蠟油保藏法，在3～6℃保藏時菌絲易于死亡，而在室溫下反而較理想，這是值得注意的。
　　
　?。ㄈ?/span>砂土管保藏法
　　
　　這是一種常用的長期保藏菌種的方法，適用于產(chǎn)孢子的放線菌、霉菌及形成芽孢的細(xì)菌，對于一些對干燥敏感的細(xì)菌如奈氏球菌、弧菌和假單胞桿菌及酵母則不適用。
　　
　　其制作方法是，先將砂與土分別洗凈、烘干、過篩（一般砂用60目篩，土用120目篩），按砂與土的比例為（1～2）：1混勻，分裝于小試管中，砂土的高度約1cm，以121℃蒸汽滅菌1～1.5h，間歇滅菌3次。50℃烘干后經(jīng)檢查無誤后備用。也有只用砂或土作載體進(jìn)行保藏的。需要保藏的菌株先用斜面培養(yǎng)基充分培養(yǎng)，再以無菌水制成108～1010個/ml菌懸液或孢子懸液滴入砂土管中，放線菌和霉菌也可直接刮下孢子與載體混勻，而后置于干燥器中抽真空約2～4h，用火焰熔封管口（或用石蠟封口），置于干燥器中，在室溫或4℃冰箱內(nèi)保藏，后者效果更好。
　　
　　砂土管法兼具低溫、干燥、隔氧和無營養(yǎng)物等諸條件，故保藏期較長、效果較好，且微生物移接方便，經(jīng)濟(jì)簡便。它比石蠟油封藏法的保藏期長，約1～10年。中國科學(xué)院微生物研究所用砂土管保藏法保藏放線菌。
　　
　?。ㄋ模?/span>麩皮保藏法
　　
　　麩皮保藏法亦稱曲法保藏。即以麩皮作載體，吸附接入的孢子，然后在低溫干燥條件下保存。其制作方法是按照不同菌種對水分要求的不同將麩皮與水以一定的比例1：（0.8～1.5）拌勻，裝量為試管體積2/5，濕熱滅菌后經(jīng)冷卻，接入新鮮培養(yǎng)的菌種，適溫培養(yǎng)至孢子長成。將試管置于盛有氯化鈣等干燥劑的干燥器中，于室溫下干燥數(shù)日后移入低溫下保藏；干燥后也可將試管用火焰熔封，再保藏，則效果更好。
　　
　　此法適用于產(chǎn)孢子的霉菌和某些放線菌，保藏期在1年以上。因操作簡單，經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，工廠較多采用。中國科學(xué)院微生物研究所采用麩皮保藏法保藏曲霉，如米曲霉、黑曲霉、泡盛曲霉等，其保藏期可達(dá)數(shù)年至數(shù)十年。
　　
　?。ㄎ澹?/span>甘油懸液保藏法
　　
　　此法是將菌種懸浮在甘油蒸餾水中，置于低溫下保藏，本法較簡便，但需置備低溫冰箱。保藏溫度若采用-20℃，保藏期約為0.5～1年，而采用-70℃，保藏期可達(dá)10年。
　　
　　將擬保藏菌種對數(shù)期的培養(yǎng)液直接與經(jīng)121℃蒸汽滅菌20min的甘油混合，并使甘油的終濃度在10％～15％，再分裝于小離心管中，置低溫冰箱中保藏?；蚬こ叹２捎帽痉ū２?。
　　
　?。?/span>冷凍真空干燥保藏法
　　
　　冷凍真空干燥保藏法又稱冷凍干燥保藏法，簡稱凍干法。它通常是用保護(hù)劑制備擬保藏菌種的細(xì)胞懸液或孢子懸液于安瓿管中，再在低溫下快速將含菌樣凍結(jié)，并減壓抽真空，使水升華將樣品脫水干燥，形成*干燥的固體菌塊。并在真空條件下立即融封，造成無氧真空環(huán)境，zui后置于低溫下，使微生物處于休眠狀態(tài)，而得以長期保藏。常用的保護(hù)劑有脫脂牛奶、血清、淀粉、葡聚糖等高分子物質(zhì)。
　　
　　由于此法同時具備低溫、干燥、缺氧的菌種保藏條件，因此保藏期長，一般達(dá)5～15年，存活率高，變異率低，是目前被廣泛采用的一種較理想的保藏方法。除不產(chǎn)孢子的絲狀真菌不宜用此法外，其他大多數(shù)微生物如病毒、細(xì)菌、放線菌、酵母菌、絲狀真菌等均可采用這種保藏方法。但該法操作比較煩瑣，技術(shù)要求較高，且需要凍干機(jī)等設(shè)備。
　　
　　保藏菌種需用時，可在無菌環(huán)境下開啟安瓿管，將無菌的培養(yǎng)基注入安瓿管中，固體菌塊溶解后，搖勻復(fù)水，然后將其接種于適宜該菌種生長的斜面上適溫培養(yǎng)即可。
　　
　?。ㄆ撸?/span>液氮超低溫保藏法
　　
　　液氮超低溫保藏法簡稱液氮保藏法或液氮法。它是以甘油、二甲基亞砜等作為保護(hù)劑，在液氮超低溫（-196℃）下保藏的方法。其主要原理是菌種細(xì)胞從常溫過渡到低溫，并在降到低溫之前，使細(xì)胞內(nèi)的自由水通過細(xì)胞膜外滲出來，以免膜內(nèi)因自由水凝結(jié)成冰晶而使細(xì)胞損傷。美國ATCC菌種保藏中心采用該法時，把菌懸液或帶菌絲的瓊脂塊經(jīng)控制致冷速度，以每分鐘下降1℃/min的速度從0℃直降到-35℃，然后保藏在-150℃～-196℃液氮冷箱中。如果降溫速度過快，由于細(xì)胞內(nèi)自由水來不及滲出胞外，形成冰晶就會損傷細(xì)胞。據(jù)研究認(rèn)為降溫的速度控制在（1～10）℃/min，細(xì)胞死亡率低；隨著速度加快，死亡率則相應(yīng)提高。
　　
　　液氮低溫保藏的保護(hù)劑，一般是選擇甘油、二甲基亞砜、糊精、血清蛋白、聚乙烯氮戊環(huán)、吐溫80等，但zui常用的是甘油（10%～20%）。不同微生物要選擇不同的保護(hù)劑，再通過試驗(yàn)加以確定保護(hù)劑的濃度，原則上是控制在不足以造成微生物致死的濃度。
　　
　　此法操作簡便、、保藏期一般可達(dá)到15年以上，是目前被*的zui有效的菌種長期保藏技術(shù)之一。除了少數(shù)對低溫?fù)p傷敏感的微生物外，該法適用于各種微生物菌種的保藏，甚至連藻類、原生動物、支原體等都能用此法獲得有效的保藏。此法的另一大優(yōu)點(diǎn)是可使用各種培養(yǎng)形式的微生物進(jìn)行保藏，無論是孢子或菌體、液體培養(yǎng)物或固體培養(yǎng)物均可采用該保藏法。其缺點(diǎn)是需購置超低溫液氮設(shè)備，且液氮消耗較多，操作費(fèi)用較高。
　　
　　要使用菌種時，從液氮罐中取出安瓿瓶，并迅速放到35～40℃溫水中，使之冰凍熔化，以無菌操作打開安瓿瓶，移接到保藏前使用的同一種培養(yǎng)基斜面上進(jìn)行培養(yǎng)。從液氮罐中取出安瓿瓶時速度要快，一般不超過1min，以防其他安瓿瓶升溫而影響保藏質(zhì)量。并且取樣時一定要戴手套以防止意外爆炸和凍傷。
　　
　　（八）宿主保藏法
　　
　　此法適用于專性活細(xì)胞寄生微生物（如病毒、立克次氏體等）。它們只能寄生在活的動植物或其他微生物體內(nèi)，故可針對宿主細(xì)胞的特性進(jìn)行保存。如植物病毒可用植物幼葉的汁液與病毒混合，冷凍或干燥保存。噬菌體可以經(jīng)過細(xì)菌培養(yǎng)擴(kuò)大后，與培養(yǎng)基混合直接保存。動物病毒可直接用病毒感染適宜的臟器或體液，然后分裝于試管中密封，低溫保存。
　　
　　在上述的菌種保藏方法中，以斜面低溫保藏法、石蠟油封藏法、宿主保藏法zui為簡便，砂土管保藏法、麩皮保藏法和甘油懸液保藏法次之；以冷凍真空干燥保藏法和液氮超低溫保藏法zui為復(fù)雜，但其保藏效果。應(yīng)用時，可根據(jù)實(shí)際需要選用。
　　
　　在的“美國典型培養(yǎng)物收藏中心”（簡寫ATCC），僅采用兩種zui有效的保藏法，即保藏期一般達(dá)5～15年的冷凍真空干燥保藏法與保藏期一般達(dá)15年以上的液氮超低溫保藏法，以達(dá)到zui大限度地減少傳代次數(shù)，避免菌種變異和衰退的目的。我國菌種保藏多采用3種方法，即斜面低溫保藏法、液氮超低溫保藏法和冷凍真空干燥保藏法。