穩(wěn)定細胞系構建的原理步驟解析

　　本文主要解析了穩(wěn)定細胞系構建的原理和穩(wěn)定細胞系建立的流程，及瞬時轉染和穩(wěn)定細胞系構建的區(qū)別與。幫助我們選擇合適的細胞轉染的方法，瞬時轉染或穩(wěn)定轉染細胞

　　真核蛋白表達的方式有兩種：瞬時轉染和穩(wěn)定轉染（穩(wěn)定細胞系構建）。根據(jù)自身真核蛋白表達的目的選擇合適的轉染方法非常重要。瞬時轉染持續(xù)時間較短，質粒轉染進入細胞，3-4天就會丟失。因此可以得到少量的蛋白。相對于此，穩(wěn)定抵不住篩選是一個長期的過程，需要足夠的耐心和細心。

　　穩(wěn)定細胞系構建原理

　　真核蛋白表達穩(wěn)定細胞系建立的原理是，將我們所要的目的基因真核到宿主細胞上，隨著細胞的生長繁殖，目的基因可以穩(wěn)定的表達，在通過抗生素的不斷加壓篩選，zui終得到構建穩(wěn)定細胞系的過程。相對于瞬時轉染，穩(wěn)定轉染技術持續(xù)周期長，細胞整合穩(wěn)定，能夠滿足后期對蛋白的大量需求。

　　穩(wěn)定細胞系構建  實驗流程

　　1.細胞培養(yǎng)

　　細胞培養(yǎng)是真核蛋白蛋白實驗中的*步，原核利用大腸桿菌，真核蛋白表達是培養(yǎng)哺乳動物細胞，常用的真核蛋白表達細胞有CHO,HEK293細胞，穩(wěn)定細胞系建立選擇CHO細胞。

　　細胞復蘇是將保存在液氮或-80℃冰箱中的細胞株解凍并重新培養(yǎng)的過程。細胞復蘇的關鍵是快復，防止在解凍過程中，產生的水珠形成冰晶損傷細胞。細胞復蘇一般步驟如下：

　　1）預先加熱水浴鍋，溫度至37-40℃，并在離心管中準備好10ml培養(yǎng)基

　　2）從液氮罐或冰箱中取出細胞，迅速放進預熱的水浴鍋中，鑷子夾住凍存管晃動，使其受熱均勻

　　3）當凍存管內*融化時，注意用酒精擦拭凍存管消毒，將液體倒入含有10ml培養(yǎng)基的離心管中

　　4）離心5min，去除上清，得到沉淀

　　5）用培養(yǎng)基懸浮沉淀，并接種到培養(yǎng)瓶常規(guī)培養(yǎng)

　　細胞復蘇后，生長一段時間，95%的細胞貼壁生長，細胞狀態(tài)良好，說明細胞復蘇成功。

　　2.穩(wěn)定細胞系構建（一）

　　以Lipofectamine轉染試劑為例進行先瞬時轉染，不同轉染試劑參考說明書

　　1）將復蘇后常規(guī)培養(yǎng)的細胞按照1-3x10^5接種到6孔板中，加入2-4ml的*培養(yǎng)基，混勻放置在二氧化碳培養(yǎng)箱中37℃過夜

　　2）無菌狀態(tài)下配置如下溶液：a 用100ul的無血清培養(yǎng)基稀釋2ug的待轉染的質粒

　　b 用100ul的無血清培養(yǎng)基稀釋25ul的Lipofectamine轉染試劑（血清的存在會影響轉染效率，因此要使用無血清培養(yǎng)基轉染）

　　3）將ab溶液混合并搖勻，室溫下放置30min左右

　　4）細胞培養(yǎng)至80%單層左右，用無血清培養(yǎng)基洗滌細胞2次，每孔加入1ml的無血清培養(yǎng)基，并將混合后的ab溶液逐滴加入到每孔，按十字方向輕搖混勻，二氧化碳培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)24小時

　　5）將轉染液倒出，換為*培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)

　　3.穩(wěn)定細胞系建立

　　24-72h加入選擇性抗生素進行穩(wěn)定細胞株篩選，預實驗確定抗生素的*濃度，確定抗生素對所選細胞的zui低作用濃度。1）提前一天接種細胞與24孔板中，待第二天長成25%單層為宜，二氧化碳培養(yǎng)箱中37℃過夜培養(yǎng)。

　　2）第二天將培養(yǎng)液換成含抗生素的培養(yǎng)基，抗生素濃度按梯度遞增（0,50,100,200,400,800，1000ug/ml）。

　　3）培養(yǎng)15天左右絕大多數(shù)細胞死亡抗生素濃度為準，一般為400-800ug/ml，篩選細胞時可適當提高濃度

　　4）二氧化碳培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)72h后按照1:10的比例將轉染細胞傳代，使用預實驗得到的抗生素濃度的培養(yǎng)基培養(yǎng)。后挑選單克隆，有限稀釋法挑取單克隆。有限稀釋法：將細胞消化下來做連續(xù)的10倍稀釋，每稀釋一梯度都在9孔板中培養(yǎng)，生長一周左右再次挑取單克隆進行培養(yǎng)，如此反復3次。

　　5）Western blot或ELISA檢測蛋白的表達情況，挑取多個單克隆進行表達檢測，篩選出表達量zui高的克隆傳代保存。

　　zui終篩選出穩(wěn)定高表達目的基因的細胞株，相對于瞬時轉染穩(wěn)定細胞系構建在后續(xù)可以節(jié)約大量的時間和成本，是滿足活性蛋白大量制備的方法。

　　真核系統(tǒng)蛋白表達的操作較為繁瑣，困難，有一定的操作難點，相對原核表達得到的蛋白更具天然活性，同酵母表達相似，可以實現(xiàn)蛋白的各種修飾，只是真核蛋白表達可以實現(xiàn)蛋白的復雜、修飾。在制藥，活性因子生產方面有很大應用。